加入酶標(biāo)記檢測抗體的核心注意事項(xiàng)

    使用酶標(biāo)記檢測抗體（常見的是酶標(biāo)二抗）是ELISA、WesternBlot、免疫組化等實(shí)驗(yàn)中的關(guān)鍵步驟。以下是需要重點(diǎn)關(guān)注的方面，分為實(shí)驗(yàn)前、實(shí)驗(yàn)中、實(shí)驗(yàn)后三個(gè)階段。

    一、實(shí)驗(yàn)前準(zhǔn)備：抗體選擇與保存

    特異性是關(guān)鍵

    宿主來源：確保檢測抗體（二抗）所針對的宿主物種與一抗的宿主物種匹配。例如，小鼠來源的一抗應(yīng)選擇抗小鼠的酶標(biāo)二抗。

    免疫球蛋白類型：確認(rèn)一抗的亞型（如IgG,IgM），并選擇針對該亞型的二抗，以獲得信號。

    交叉吸附：在進(jìn)行多重檢測或樣本含有多種物種蛋白時(shí)，應(yīng)選擇經(jīng)過交叉吸附的二抗，以減少非特異性結(jié)合。

    酶與底物系統(tǒng)的選擇

    HRP（辣根過氧化物酶）：

    優(yōu)點(diǎn)：成本低、靈敏度高、底物多樣（如TMB,DAB）。

    注意事項(xiàng)：嚴(yán)禁使用含疊氮鈉（NaN?）的緩沖液，因?yàn)镹aN?是HRP的抑制劑。同時(shí)，要避免溶液被微生物污染。某些還原劑（如DTT）也會(huì)使其失活。

    AP（堿性磷酸酶）：

    優(yōu)點(diǎn)：穩(wěn)定性好，不受NaN?影響。

    注意事項(xiàng)：應(yīng)避免使用含有磷酸根離子的緩沖液（如PBS），因?yàn)榱姿岣茿P的競爭性抑制劑。推薦使用Tris緩沖液。

    抗體的保存與稀釋

    正確保存：嚴(yán)格按照說明書要求保存，通常是-20℃分裝凍存，避免反復(fù)凍融。

    使用前離心：短暫離心小管，將液體收集至管底，避免損失和起泡。

    優(yōu)化稀釋比例：必須進(jìn)行預(yù)實(shí)驗(yàn)來優(yōu)化二抗的稀釋比例。說明書提供的范圍是一個(gè)參考起點(diǎn)。濃度過高會(huì)導(dǎo)致背景深，濃度過低則信號弱。

    二、實(shí)驗(yàn)過程中：孵育與洗滌

    封閉要充分

    在加入檢測抗體前，必須用惰性蛋白（如BSA、脫脂奶粉、血清等）對膜或板進(jìn)行充分封閉，以封堵非特異性結(jié)合位點(diǎn)，這是降低背景的關(guān)鍵。

    孵育條件優(yōu)化

    溫度與時(shí)間：室溫孵育1小時(shí)或4℃過夜。4℃過夜通常結(jié)合更牢固，背景更低，但需要更長時(shí)間。室溫孵育更快捷，但需注意控制時(shí)間和溫度，避免背景過高。

    避光：如果酶標(biāo)抗體偶聯(lián)了熒光染料，整個(gè)孵育過程需避光。

    均勻孵育：確保抗體溶液能均勻覆蓋整個(gè)樣本，放在搖床緩慢搖動(dòng)孵育效果更佳。

    洗滌至關(guān)重要

    洗滌：孵育后，必須使用洗滌緩沖液（如TBST、PBST）進(jìn)行充分且嚴(yán)格的洗滌，以去除未結(jié)合的游離抗體。這是降低背景有效的一步。

    洗滌次數(shù)與體積：通常建議洗滌3-5次，每次浸泡并搖動(dòng)3-5分鐘。使用足量的洗滌液。

    三、實(shí)驗(yàn)后：顯色與結(jié)果分析

    底物使用與顯色

    新鮮配制：尤其是HRP的底物，建議在使用前新鮮配制，以保證其活性。

    避光反應(yīng)：某些底物（如ECL）對光敏感，顯色反應(yīng)需在暗室進(jìn)行。

    控制反應(yīng)時(shí)間：顯色反應(yīng)時(shí)間不宜過長，否則會(huì)導(dǎo)致背景過高。一旦達(dá)到理想的信號強(qiáng)度，應(yīng)及時(shí)終止反應(yīng)（對于ELISA）或進(jìn)行成像（對于WB）。

    設(shè)立對照

    陰性對照：不加一抗（只加封閉液和二抗），用于評估二抗的非特異性結(jié)合背景。

    空白對照：不加一抗和二抗，用于評估底物自身的顯色情況。

    陽性對照：使用已知陽性的樣本，確保整個(gè)實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)工作正常。

    總結(jié)

    成功使用酶標(biāo)記檢測抗體是一個(gè)系統(tǒng)性的優(yōu)化過程，核心在于：

    選對（特異性）

    用好（稀釋度、孵育條件）

    洗凈（降低背景）

    控好（底物反應(yīng)與對照）

    遵循以上注意事項(xiàng)，將能顯著提高實(shí)驗(yàn)的可靠性、靈敏度和重復(fù)性。

    注：以上僅供參考，不作為實(shí)際數(shù)據(jù)，實(shí)驗(yàn)需嚴(yán)格遵循說明或咨詢技術(shù)老師。

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